식물조직배양및실험

Ⅳ. 올바른 clone 선택 1) Plasmid DNA 분리 주로 miniprep이라고 부르는 이 방법은 plasmid DNA를 소량 분리하는 방법으로 가장 보편적으로 사용되는 방법인 Alkali lysis method이다. 기본원리는 세균의 cell wall과 cell membrane을 부수고 DNA만을 분리하는 것으로 이 때 중요한 것은 세균이 원래 가지고 있는 chromosomal DNA와 plasmid DNA를 구분하여 분리하는 것인데 이 둘은 모두 DNA이므로 성질이 비슷하기 때문에 구분하여 분리하기가 쉽지 않다. 다행히 chromosomal DNA는 분리 과정에서 linear 형태가 되고 크기가 상당히 크기 때문에 이런 성질의 차이를 이용하면 분리할 수 있다. ※ Alkali lysis method 의 원리 ① 세포벽을 깬다. 이 때 세포막은 유지되도록 한다. 세포벽을 군데군데 무너뜨리는 물질은 EDTA이며, 이때 sucrose나 glucose가 첨가되어 세포의 형태를 유지하도록 하는데 lysozyme을 쓰기도 한다. ② 세포막을 조심스럽게 깨서 크기가 큰 chromosomal DNA가 너무 잘게 조각나는 것을 방지하면서 용액에 DNA를 노출시킨다. SDS라는 detergent가 세포막을 녹여버리면서 안에 있던 세포 내용물이 용액으로 흘러나오게 되는데 이때 alkali 용액에 노출된 DNA 는 모두 denature 되지만 크기가 작은 supercoiled plasmid DNA는 그다지 심각하게 되지 않는 성질을 이용하는 것이다. ③ pH를 급격히 7.0까지 복구시키면 크기가 작고 supercoiled form을 유지하고 있던 plasmid는 비교적 renaturation이 잘 되지만, chromosomal DNA는 미처 renature되지 못하고 엉기게 되는데 이렇게 엉긴 chromosomal DNA를 원심분리로 제거한다. 그러면