Ni-NTA column을 이용한 단백질 정제

우리가 실험한 F.T의 결과를 보면, C.E와 비교해서 한부분의 밴드를 제외하고, Ni-NTA에 특이적인 affinity를 나타내지 않는 단백질들은 모두 흘러 나왔다는 사실을 알 수 있다. 또, SDS-PAGE를 통한 Marker와의 비교로 C.E에는 나타나고 F.T에는 나타나지 않는 밴드가 약 20KDa 정도의 크기를 갖는 단백질이라는 것 또한 확인할 수 있다.

이 실험에서는 Elution 과정이 중요한데 histidine과 구조가 비슷한 Imidazole을 고농도(100~300mM)로 Buffer를 만들어서 컬럼에 순차적으로 가하여 histidine과 Ni2+과의 결합이 약해지게 되면 표지된 단백질이 떨어져 나오는 과정이다.

Elution1,2,3 결과를 차례로 보면, E1은 아무래도 이전과정에서의 wash buffer가 포함되어있어서 우리가 분리하고자 하는 단백질의 밴드가 선명하게 나타나지 않았고, 오히려 이과정은 E2 결과를 확실히 나타나도록 해주는 기능을 한 것을 알 수 있었다. 그래서 E2결과는 C.E에는 있지만 F.T에는 없는 단백질 즉, 우리가 분리하고자하는 단백질의 밴드가 E1보다 좀더 선명하게 나타나는 것을 알 수 있다. E3에서는 E2에서 단백질이 이미 많이 분리되어 나와서 그런지 잘 나타나지 않았다…(생략)