Orexins과 orexin 수용기

우리의 전반적 전략은 평행하게 검사되는 다 orphan GPCRs-expressing cell lines을 이용해서 GPCR-길항작용을 위한 다양한 조직추출물의 고위-분해 HPLC분절을 분류하는 것이었다. 이러한 목적을 위해서, 우리는 50개 이상의 안정된 transfectant cell lines을 만들었다. 각각 나타나는 별개의 orphan GPCR cDNA가 이들 수용기에 대한 내분비성 ligand을 밝히기 위해 reporter cell lines으로 이용될 수 있다. 우리는 조직추출물로부터 유래된 HPLC분절을 가진 세포를 의심했고 이종삼중 G 단백질 활성화를 위한 수많은 신호전달 read-outs을 모니터했다. 이 방법에서 전위문제는 host cell line내에 수많은 내분비성 GPCRs이 존재하기 때문이다. 이 문제를 책략하기 위해서, 우리는 최소한 2-3개의 독립된 transfectant cell lines에 대한 활동분절을 분석했다. 이것은 우리로 하여금 활동분절이 특수한 수용기를 나타내는 세포만을 활성화하는 연구를 할수 있게 해주었다. 이런 과정에서 우리는 근원적으로 HFGAN72로 명명된 독립 GPCRs를 나타내는 HEK293 cells내에 Cytoplasmic Ca2+레벨([Ca2+]i)의 격렬한 증가를 나타내는 백서의 뇌추출물의 역-단계 HPLC분절을 발견했다(그림 1). 이 수용기는 처음에 인간 뇌로부터 expressed sequence tag(EST)으로 밝혀졌다(그림 2C). 큰활동정점(그림 1A에서 `A`로 표시된)은 두 개의 부수적인 작은 정점(그림 1A에서 B와 B`)에 의해 재생할수 있도록 동반되었다. 이 활동들은 HFGAN72 수용기를 위해 특수하게 되는 것으로 보였다. 활동분절은 관련이 없는 독립 수용기를 나타내는 세포, HPRAJ70에서 탐지할수 있는 [Ca2+]i 순간을 자극하는데 실패했다(그림 1). 이들 활동은 활동분절의 단백효소 치료가 활동을 파괴했기 때문에 peptidic 되는것으로 보였다.