Plaque Hybridization

1. 15 ml cornical tube에 준비된 phage plating 세포를 200 ml 씩 분주한다. 2. Infection 시키고자 하는 phage의 숫자를 함유하는 희석된 library 용액을 준비한다. u 90 mm plate일 경우 10,000 pfu, 150 mm plate의 경우 30,000 pfu의 phage를 infection시켜 agar plate에서 배양한 후 screen할 수 있다. 이 이상의 숫자로 infection시킬 경우 screening이 어려워진다. 또한 세포의 양도 150 mm plate의 경우 500 ml를 사용하여야 한다. Infection 시키는 phage 용액은 1x lambda dilution buffer에 희석되어야 하며 용량은 phage plating 세포량의 1/2이 되도록 한다. 3. Phage plating 세포가 담겨 있는 cornical tube에 100 ml의 phage 용액을 가하고 잘 섞은 후 37°C에서 15분간 방치한다. 4. 48°C로 온도를 맞춘 10 mM MgSO4가 함유된 LB top agarose를 4 ml 가하고 거품이 생기지 않도록 주의하며 잘 섞은 후 즉시 90 mm LB plate에 부어 고루 퍼지게 한 후 수평판 위에서 약 10분간 방치한다. 5. Plate를 37°C 배양기에서 6시간 내지 10시간 동안 배양한다. u Phage가 infection되어 형성된 plaque는 약 5시간 이후부터 보이기 시작한다. 배양시간은 형성되는 plaque의 상태에 따라 결정하여야 한다. Plaque의 크기가 너무 작아도 hybridization signal이 약할 수 있고 너무 커서 인접한 plaque와 완전히 섞여버려도 selection이 어려워진다. Plaque끼리 서로 인접하여 bacterial lawn이 드문드문 남아 있을 정도로 배양하도록 한다. 6. Hybridization에 사용할 nylon membrane을 덮기 위하여 4°C에서 …
6. H…