단백질 분리와 전기 영동

1) 전체 세포단백질(whole cellular extract)의 분리 실험방법 1. 단층으로 자란 배양세포를 1 ml의 PBS로 두번 세척한다. 2. 배양접시에 붙은 상태로 얼음에 올려놓고 300 ml의 용해용액(RIPA 용액: 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0.5% DOC[deoxycholic acid], 0.1% SDS, 50 mM Tris-Cl, pH 7.5)을 가한다. 3. 30분간 가끔씩 흔들면서 얼음에 둔다. 4. 1 ml pipette을 사용하여 수차례에 걸쳐 lysate를 올렸다, 내렸다를 반복하여 뻑뻑하지 않을 때까지 시행하면 genomic DNA가 모두 shearing 되었다고 볼 수 있다. 5. 이 용액을 미세원침관으로 옮기고 4°C,15,000 rpm에서 10분간 원심분리한다. 6. 상층액(세포단백질)을 새 미세원침관으로 옮긴다. 이 용액은 SDS-PAGE에 이용할 수 있다. 2) 핵단백질(nuclear extract)의 분리 핵단백질의 분리는 1단계의 핵분리과정과 2단계의 단백질 분리과정으로 나눌 수 있으며, 핵을 분리하는 방법에 따라서 여러가지 방법이 있다. 순수한 핵단백질을 원하는 경우 핵분리를 순수하게 해야 하지만 시간과 노력이 많이 들기 때문에 여러가지 세포에서 동시에 분리하기에는 어려움이 많다. 여기에 소개하는 방법은 Schreiber 등(1989)이 소개한 간단한 방법이다. u 실험재료 용액 A: 10 mM HEPES, pH 7.9, 10 mM KCl, 0.1 mM EDTA, 0.1 mM EGTA로 구성되고, 사용 직전에 DTT(dithiothreitol)을 1 mM로, PMSF(phenylmethylsulfonyl fluoride)를 0.5 mM로, 그리고 여러가지 protease inhibitor cocktail을 목적에 따라 만들어서 첨가하여 사용한다.