[의학,약학] [생물학 실험] DNA의 분리 실험

1. Abstract & Introduction

DNA 절편을 클로닝하기 위한 방법들의 공통된 특징 중 하나는 박테리아와 플리스미드를 이용하는 것이다. 박테리아 플라스미드는 비교적 작고, 염색체로부터 분리된 상태로 복제하는 원형의 DNA라는 것을 설명하였다. 플라스미드는 몇 개의 우전자만 가지고 있고 특정조건에서 박테리아를 배양할 때 유용하게 사용된다. 실험실에서 유전자나 DNA 절편을 클로닝하기 위해서는, 먼저 플라스미드를 박테리아에서 분리한 후 외분의 DNA를 플라스미드에 집어넣는다.
이번 실험은 박테리아에서 플라스미드를 추출해 내는 실험으로 이렇게 적은 양의 박테리아로부터 플라스미드 DNA를 추출하는 방법을 miniprep라고 한다. 여기서는 유전자 재조합 DNA가 들어있는 대장균으로부터 직접 플라스미드를 추출하여 다음 실험에 이용할 표본을 만들어 놓는다.

2.Materials

-Echerichia coli(Competent cell : DH5α), plasmid DNA(pUC19 vector
-마이크로 피펫, 소형 원심분리기, E-tube, Ice, plasmid DNA purification kit
-Buffer 조성
Resuspension buffer
50mM glucose, 25mM TrisCl (pH 8.0), 10mM EDTA (pH 8.0), RNase A
Lysis buffer
0.2N NaOH, 1% SDS
Neutralization buffer
5M potassium acetate, glacial acetic acid

3.Method

1. colony 1개를 Antibiotics(예 - Ampicillin)가 포함된 liquid LB 5ml에 접종하고
37도℃ shaking incubator에서 12~16시간(O/N) 키운다.
…

4. Resuspension buffer를 250㎕넣고 vortexing을 하여 pellet을 완전히 풀어준다.

5. Lysis buffer를 250㎕넣고 5~6회 inverting해준다.

6. Neutralization buffer를 350㎕넣고 9~10회 inverting해준다.

7. 12,000rpm에서 10분간 원심분리한다.

8. 상층액을 column에 옮긴다. (주의-pellet이 딸려오지 않게 한다)

9. 12,000rpm에서 1분간 원심분리하고 collection tube에 있는 용액을 버린다.

10. Washing bufferA 700㎕를 넣고 1분 원심분리하고 collection tube의 용액을 버린다.

11. Washing bufferB 700㎕를 넣고 1분 원심분리하고 collection tube의 용액을 버린다.

11. 빈 collection tube에 column을 끼우고 12,000rpm에서 1분 동안 원심분리한다.

12. column을 E-tube에 옮기고 50㎕의 elution buffer를 넣은 후 1분간 incubation한다.

13. 12,000rpm에서 1분간 원심분리한다.

4.Discussion

이번 실험에 사용된 mini-prep이라고 부르는 방법은 plasmid DNA를 소량 분리하는 방법이다. 가장 보편적으로 사용되는 방법인 Alkali lysis method이다. 기본적인 원리는 그림에서 보듯이 세균의 cell wall과 cell membrane을 부수고 DNA 만을 분리하는 것이다. 이 때 중요한 것은 세균이 원래 가지고 있는 chromosomal DNA와 plasmid DNA를 구분하여 분리하는 것이다. 이 둘은 모두 DNA이므로 성질이 비슷하기 때문에