유전공학 실험 - PCR과 Transformation

PCR과 Transformation 실험 일시 : 1. Introduction 유전자를 cloning하여 vector에 주입하여 대장균에 주입하여 발현 정도를 관찰한다. 2. Materials DNA template, primer, DW, DNA polymerase & Buffer, dNTPs (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), PCR tube, micro pipette, column, buffer PB, buffer NW, buffer EB, T vector, 2X Rapid Ligation Buffer, pGEM-T or pGEM-T Easy Vector (50 ng), PCR product, T4 DNA Ligase, gel, 도말 plate, 따뜻한 물, shaking machine 3. Methods 1) 형광 발현 유전자를 PCR로 cloning한다. ① 튜브에 DNA template 1㎕, FW primer 2㎕, RV primer 2㎕, DW 15㎕를 넣으려고 하였으나 실패의 가능성이 있으므로 각각 2배의 양으로 한다. ② 그 다음 polymerase, buffer들이 있는 PCR tube에 옮겨 담은 다음 잘 섞이도록 pipetting을 해준다. PCR tube에는 라벨링을 한다. ▶ PCR tube 속에 있는 파란 물질은 염색을 하기 위한 용도로 전기영동 시에 홈에 주입하였는지 확인을 더 쉽게 할 수 있다. ③ 94℃에서 2분 동안 진행하고 94℃에서 30초, 58℃에서 30초, 72℃에서 1분 30초로 한 cycle을 설정하여 35cycle을 진행한다. 그런 후 4℃에서 보관한다. ▶ cycle이나 온도, 시간의 설정은 충분히 primer가 붙을 수 있도록 설정한다. ④ 2㎕을 전기영동한다. 2) PCR산물을 분리, 정제한다. ① PCR산물의 볼륨의 5배에 해당하는 양의 buffer PB를 넣은 후에 준비된 column에 모두 옮겨 담고 30초 동안 원심분리 한다. ② 아래쪽에 필터링 …
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