유전공학 실험 - PCR과 Transformation

PCR과 Transformation
실험 일시 :

1. Introduction

유전자를 cloning하여 vector에 주입하여 대장균에 주입하여 발현 정도를 관찰한다.

2. Materials

DNA template, primer, DW, DNA polymerase & Buffer, dNTPs (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), PCR tube, micro pipette, column, buffer PB, buffer NW, buffer EB, T vector, 2X Rapid Ligation Buffer, pGEM-T or pGEM-T Easy Vector (50 ng), PCR product, T4 DNA Ligase, gel, 도말 plate, 따뜻한 물, shaking machine

3. Methods

1) 형광 발현 유전자를 PCR로 cloning한다.

① 튜브에 DNA template 1㎕, FW primer 2㎕, RV primer 2㎕, DW 15㎕를 넣으려고 하였으나 실패의 가능성이 있으므로 각각 2배의 양으로 한다.

② 그 다음 polymerase, buffer들이 있는 PCR tube에 옮겨 담은 다음 잘 섞이도록 pipetting을 해준다. PCR tube에는 라벨링을 한다.

▶ PCR tube 속에 있는 파란 물질은 염색을 하기 위한 용도로 전기영동 시에 홈에 주입하였는지 확인을 더 쉽게 할 수 있다.

③ 94℃에서 2분 동안 진행하고 94℃에서 30초, 58℃에서 30초, 72℃에서 1분 30초로 한 cycle을 설정하여 35cycle을 진행한다. 그런 후 4℃에서 보관한다.

▶…(생략)

④ 2㎕을 전기영동한다.

2) PCR산물을 분리, 정제한다.

① PCR산물의 볼륨의 5배에 해당하는 양의 buffer PB를 넣은 후에 준비된 column에 모두 옮겨 담고 30초 동안 원심분리 한다.

② 아래쪽에 필터링 된 물질을 pipette으로 제거한 후 buffer NW를 700㎕ 추가한 후에 30초 동안 원심분리 한다. 원심분리 후에는 필터링 된 물질을 제거한다.

③ 1분 동안 추가적으로 원심분리를 하고난 후에 새로운 1.5ml tube로 column을 옮긴다.

④ 30㎕의 buffer EB를 넣고 1분 동안 원심분리를 한다.

⑤ 1.5ml tube에 있는 물질이 정제된 PCR산물.

⑥ 2㎕을 전기영동한다.

3) 2X Rapid Ligation Buffer - 5 ㎕, pGEM-T Easy Vector (50 ng) - 1 ㎕, PCR product - 3 ㎕, T4 DNA Ligase - 1 ㎕로 총 10㎕를 튜브에 넣고 이 튜브를 1시간 동안 실온에 보관한다.

4) 칼슘을 처리한 박테리아가 해동될 때 까지 얼음에 보관하고 이후 조심스럽게 세포를 반응 튜브 안으로 주입한다.

5) 튜브를 얼음에 30초 동안 보관한다,

6) 42℃의 물에 90초 동안 놔두었다가 이후 즉시 2분간 얼음에 다시 놔둔다.

7) 실온에서 SOC medium 800㎕에 반응한 산물을 넣고 37℃에서 45분 동안 인큐베이터에서 shaking한다.

8) 도말할 gel을 미리 만들어 plate에 부어 굳힌다.

9) transformation된 산물을 인큐베이터 안에서 plate에 도말하여 하루 밤이 지나면 관찰한다. ▶ 실제 관찰은 실험이 끝난 후 5일 뒤 관찰.

4. Results

1) 전기영동 확인 결과

2) transformation 확인