[의학,약학]잎으로부터의 DNA 추출과 전기영동

잎으로부터의 DNA 추출과 전기영동

1. 생체시료의 초저온 장기보존을 위해 deepfreezer를 이용하는 것과 액체질소보존탱크를 이용하는 경우 각 system의 성질과 장단점을 비교설명 하시오.

deepfreezer는 초저온냉동고로 -80℃에서 sample과 같은 것을 장기간 동안 보관할 수 있지만 비용이 많이 들고 전기가 많이 소요된다는 단점이 있다.
액체질소보존탱크는 액체질소(-196℃ 상태)를 이용하여 유전자, 조직세포, 골수, 수정란 등을 저장한다. 액체 질소는 낮은 온도를 유지할 수 있으면서도 값이 싸고 쉽게 만들 수 있기 때문에 많이 이용된다. 하지만 액체질소보존탱크는 원하는 물질을 넣어둔 vial의 뚜껑사이로 액체질소가 스며들어 오염의 가능성이 있으며 매번 액체질소를 충전해야한다는 단점이 있다. 또한 액체질소를 사용하다가 손에 튀어 다칠 위험성도 있으며 액체질소탱크 내부에 온도 편차가 있을 수도 있다.

2. 식물시료로부터 DNA를 추출하는 과정과 그 원리를 단계별로 설명하시오.

① 실험 시작 전 중탕기를 65도에 맞추어 놓는다.

② 약 47cm 정도 되는 여러 가지 식물 잎을 막자사발에 넣고 저온장갑을 낀 뒤 액체질소를 붓고 파쇄시킨다.

→식물은 세포벽을 갖고 있어 세포벽을 파쇄하여야 세포 내 내용물이 나와 DNA 추출이 가능하다. 이를 위해 액체질소를 이용하여 막자사발로 식물조직을 분쇄하는 것이다.

③ 파쇄한 즉시 약수저를 이용하여 50mL tube에 약 0.5g을 넣고 즉시 준비된 추출용액(CTAB buffer) 10mL를 넣는다.

→파쇄된 조직을 extraction buffer(CTAB buffer)와 섞으면 조직으로부터 DNA가 분리된다. 이는 버퍼속의 ETDA가 킬레이트 작용을 하기 때문이다. 여기서 킬레이트란 …

④ Vortexing 한 후 65도 중탕기에서 5분동안 중탕하고 꺼내서 흔들어 준뒤 다시 5분동안 중탕한다.

⑤ 10mL의 chloroform/Isoamylalchole(24:1) 액을 넣고 뚜껑을 닫고 3~4번 뒤집어 주어 잘 섞이게 한다. Chloroform과 Isoamylalchole은 냄새가 심한 유독성 물질이므로 fumehood내에서 다룬다.

⑥ Swing-bucket centrifuge를 이용하여 3000rpm에서 5분간 원심분리한다.

⑦ 스포이드를 이용하여 상등액만 새 tube로 옮긴다. 이때 아래로 가라앉은 식물조직, chloroform, isoamylalchloe은 나중에 폐기통에 폐기한다.

⑧ 옮겨진 상등액 부피에 대한 2/3부피의 isopropanol을 피펫을 이용하여 넣고 뚜껑을 닫고 3~4번 뒤집어 주어 DNA가 엉기는 것을 확인한다.

⑨ 3000rpm으로 두고 4도로 유지하여 5분간 원심분리 한다.

⑩ 뚜껑을 열고 상등액을 따라