단백질정량실험

단백질 정량 실험

1.실험목적

단백질에 대해 알아보고 Biure에 의한 정량을 이용해 단백질을 정량하고 흡광도를 이용하여 BSA표준 용액과 미지의 단백질 용액을 비교하여 농도를 알아보는 것이다.

2.실험이론

→단백질 정량을 하는 이유
단백질 정량이란 시료 내에 포함된 단백질의 양, 또는 농도를 구하는 과정으로써 대부분의 생화학실험의 기본이 되는 과정이라고 할 수 있다. 새물학 분야의 경우 다른 분야보다 결과를 볼 때까지 뭔가 잘못되었다는 것을 알기 어려워, 준비 단계에서의 단백질 정량이 잘못 이루어지면 헛수고를 하거나 잘못된 결과를 얻을 수 있다. 이러한 이유 때문에 단백질 정량을 정확하게 하는 것은 매우 중요하다. 또한 정확성 뿐만 아니라 대부분의 실험에서 반복적으로 사용하게 되므로 간편성 역시 중요하게 여겨지기 때문에 실험에 따라서 다양한 단백질 정량 방법이 사용되고 있다.

①Lambert-Beer의 법칙

시료용액을 통과한 빛의 양(Transmittance, T)은 흡광물질이 존재하지 않았을 때의 빛의 강도(Io)에 대한 흡광물질이 존재할 때의 빛의 강도(I), 즉 T=I/Io로 표시되기 때문에 빛의 통과율은 항상 1보다 작으며 다음과 같이 %로 표시될 수 있다.
%T = T
빛의 통과율은 시료의 농도와 특별한 상관관계를 나타내지 않지만 그 로그함수는 다음과 같이 시료의 농도와 일정한 상관관계를 나타낸다.
-logT = K×C
여기서 C는 시료 중의 흡광물질의 농도이고 K는 상수이다. 위의 식에서 -logT를 흡광도 (absorbance, A)라고 한다면 흡광도는 시료의 농도와 특별한 상관관계를 지니게 된다. 그러므로 강도를 비교하여 얻어지는 것이다.
A=K×C (흡광도 = 흡광물질의 상수×흡광물질의 농도)

②Biuret반응

정확성은 떨어지지…

③흡광광도법

④UV법

3.실험 기구 및 시약

①실험기구 - 마이크로피펫. 분광광도기, 튜브, 시험관, 메스실린더, 비커, 혼합기

②시약 - 2.35mg나트륨 칼륨 주석 산염, 0.75mg 황산염, 1.25 요오드, 0.8mg 수산화나트륨, 증류수, BSA, 미지단백질시료

4.실험 방법

① 뷰렛 시약을 만들기 위해 2.35mg나트륨 칼륨 주석 산염, 0.75mg 황산염, 1.25mg 요오드, 0.8mg 수산화나트륨을 비커에 넣고 증류수를 넣어서 부피를 100ml를 맞춘다.

② BSA를 증류수에 넣어서 희석시킨다. 농도를 0, 0.2 0.4, 0.6, 0.8, 1.0(mg/ml) 5가지로 나눈다. 뷰렛시약을 1ml씩 넣는다.

③ 미지 단백질을 1/10, 1/100, 1/1000으로 희석시키고 뷰렛시약을 1ml씩 넣는다.

④ 분광광도계를 이용하여 BSA흡광도를 체크해서 표준곡선을 그리고, 미지 단백질 시료의 흡광도를 체크해서 곡선을 그리고 농도를 알아본다.