[생명공학 Plasmid DNA preparation

(1) 실험 제목 : Plasmid DNA preparation

(2) 실험 목적 : Ampicillin에 대하여 저항성을 지닌 E. coli (XLI-Blue, Amp-r) 의 plasmid

DNA【pBlue스크립트 SKⅡ(+)】를 isolation 한다.

(3) 실험 원리 :

Plasmid DNA를 정제하기 위해서 여러 가지 방법들이 사용되는데 공통적으로 다음의 세 과정- 미생물의 배양과 플라스미드 증폭 ; 미생물 수거와 cell lysis ; plasmid DNA 정제-을 거친다.
DNA를 분리하기 위해서는 일단 DNA가 세포 밖으로 유출되도록 세포벽 및 세포막을 분해 시켜야 하고, 이때 DNA 가수분해 효소들의 활성을 억제하는 조건에서 DNA를 분리해야 하며 단백질이나 RNA가 같이 회수되지 않도록 해야 한다.
세포벽을 가지는 박테리아의 경우에는 먼저 lysozyme을 처리하여 세포벽을 분해 시키며 세포막은 detergent인 SDS를 처리함으로써 분해 시킨다. SDS는 세포막을 분해 시킬 뿐만 아니라 단백질을 변성시킬 수 있어 핵산 가수분해효소들의 작용을 억제할 수 있다. 단백질들은 phenol과 chloroform을 처리함으로써 제거할 수 있다. DNA는 alcohol에 의한 침전으로 얻을 수 있다. RNA는 RNase에 의해…(생략)

(4) 실험 재료 :

① Strain : Plasmid DNA【pBlue스크립트 SKⅡ(+)】

② LB (containing Ampicillin) broth

③ Solution I (100 mL)

③ Solution Ⅱ (100 mL)

④ Solution Ⅲ (100 mL)

⑤ TE buffer (100 mL)

? 1 mM EDTA (pH 8.0) (MW〓372.2, 0.04 g)

⑥ Ethanol, 7