생물학 실험보고서 - DNA work

[생물학실험보고서]

1. 실험 제목 : DNA work

2. 실험 목적 : 세균의 세포벽을 파괴하고 plasmid DNA를 분리한다. 분리한 plasmid DNA를 형질전환을 시키고 배지에서 키운다. 배지에서 키운후 제한효소를 이용해 잘라낸뒤 전기영동을 시켜서 관찰한다.

3. 재료 :

-Echerichia coli(Competent cell : DH5α), plasmid DNA(pUC19 vector, 마이크로 피펫, 소형 원심분리기, E-tube, Ice, plasmid DNA purification kit, Resuspension buffer(50mM glucose, 25mM Tris·Cl (pH 8.0), 10mM EDTA (pH 8.0), RNase A), Lysis buffer(0.2N NaOH, 1% SDS), Neutralization buffer(5M potassium acetate, glacial acetic acid), competent cell, spreader, alcohol lamp, LA plate, water bath, DNA, restriction enzyme, enzyme buffer, 1kb marker, loading dye, 1xTAE buffer, agarose, EtBr, electrophoresis kit, gel 판, comb, hand detector

4. 실험과정

1. colony 1개를 Antibiotics(예 - Ampicillin)가 포함된 liquid LB 5ml에 접종하고
37도℃ shaking incubator에서 12~16시간(O/N) 키웠다.
2. Bacteria가 자란 LB중 1ml을 E-tube로 옮겼다.
3. 12,000rpm 30초(또는 3,000rpm 15분)간 원심분리하고 상층액을 완전히 버렸다.
4. Resuspension buffer를 …

5. Lysis buffer를 250㎕넣고 5~6회 inverting해주었다.

6. Neutralization buffer를 350㎕넣고 9~10회 inverting해주었다.

7. 12,000rpm에서 10분간 원심분리하였다.

8. 상층액을 column에 옮겼다.

9. 12,000rpm에서 1분간 원심분리하고 collection tube에 있는 용액을 버렸다.

10. Washing bufferA 700㎕를 넣고 1분 원심분리하고 collection tube의 용액을 버렸다.

11. Washing bufferB 700㎕를 넣고 1분 원심분리하고 collection tube의 용액을 버렸다.

11. 빈 collection tube에 column을 끼우고 12,000rpm에서 1분 동안 원심분리하였다.

12. column을 E-tube에 옮기고 50㎕의 elution buffer를 넣은 후 1분간 incubation하였다.

13. 12,000rpm에서 1분간 원심분리하였다.

14. competent cell을 20ul에 지난주에 뽑았던 DNA를 1ng 넣었다.

15. 1초간 voltexing 하였다.

16. 42도에 45초 정도 heatshock을 주었다.

17. 1초간 voltexing 하였다.

18. LB 배지에 Amp를 추가한배지와 추가하지 않은 배지를 구분하였다.

19. LB plate에 tube Amp+와 Amp-를 각각 뿌려주었다.

20. 두 plate를 유리 spreader로 도말한 후 37도에서 12~16시간 incubation시켰다.

21. 준비해둔 DNA를 제한효소로 반응을 시켰다. (Single cut, Sal 1)

(D.W 〓 13ul , 10 x bf 〓 2ul , 10 x BSA 〓 2ul , DNA 〓 2ul , Sal 1 〓 1ul)

22. 반응시킬 동안 1.0% Gel 을 만들었다.

23. 작은 판 4개 기준으로 1xTAE 100ml에 agarose 1.0g을 넣었다.

24. 전자렌지에 2분 정도 돌린 후 식힌 다음 Etb