시료의 균질화 및 단백질 정량

실험목적

1. 세포내 물질을 연구하기 위해 세포로부터 세포내 물질을 얻어내기 위해 조직이나 세포 의 구조를 파괴시키고 균질화 하는 작업이 필요하다. 이번 실험에서는 초음파 파쇄기를 이용하여 시료를 균질화 하는 작업을 하도록 한다.

2. 생화학적 분석은 시료내부의 생물학적인 구성분의 특징을 알아보는 것이다. 그중 정량 분석은 물질을 구성하는 양적관계를 조사하는 것이다. 이번 실험에서는 색의 변화를 이 용하는 비색정량분석 중 Lowry법을 이용하여 단백질을 정량하여 보관한다.

시약 및 기구
1. 초음파 파쇄기(ultrasonicator) - 초음파를 발생시켜 용액 내의 물분자의 운동속도를 증가 시킴으로써 세포막에 충격을 줘 세포막을 와해시킨다.
2. TMDEG : 완충용액(T : tris - 용액 자체 내 완충작용, M : , D : DTT - 환원제, E : EDTA - 이온을 잡아줌, G : glyce - 운동성에 대한 완충작용)

3. 원심분리기

4. Lowry A stock sol. : 2% in 0.1 N - Lowry B의 가 단백질 에 잘 붙도록 도와주는 역할

5. Lowry B : 1% ·5 in D·W - 가 단백질 peptide에 붙는다.

6. Lowry C : 2% Sodium-potassium tartrate - Lowry B의 가 단백질에 잘 붙도 록 도와주는 역할

7. Folin`s reagent (2N) : for use, 1:1 dilute W/D·W -> 1N

8. 1 Bovine serum albumin (BSA) - 단백질 표준용액

9. 5 1회용 시험관(test tube)

10. 미세피펫(Micropipettes)

11. Tips

12. Cuvette

13. 분광광도계(Spectrophotometer)

14. Vortex

실…(생략)

-시료의 균질화

1. 수확한 세포를 TMDEG(완충용액) 300에 넣고 vortex로 섞어준다.

※ 주의 : 단백질 손상을 막기 위해 시료가 담긴 용기를 항상 얼음에 넣어서 사용할 것!

2. 초음파 파쇄기의 tip이 microtube의 세포 현탁액의 3/5 정도 깊이까지 잠기게 한다.

☞ 얼음 때문에 잘 안 보일 수 있으므로 주의하고 tip의 위치와 눈의 위치를 맞춰서 보도