[자연과학] 일반생물학 실험 - Polymerase chain reaction(PCR)

Polymerase chain reaction(PCR) technique은 1980년대 중반 K. Mullis에 의해서 고안된 기술이다. 이 PCR techinique은 유전자를 연구, 분석하는 분자유전학에 혁신을 일으켰다. 유전자를 분석하고 연구하는데 있어서 가장 큰 문제점은 복잡한 전체 genome중에 연구하고자 하는 유전자가 희귀하다는 것인데, PCR은 특정 DNA Sequence의 copy수를 기하급수적으로 증폭시킬 수 있다.
PCR은 DNA polymerase에 의한 DNA 복제의 특징을 이용한다. DNA polymerase가 외가닥 DNA를 주형으로 해서 상보적인 DNA를 합성한다. 이러한 외가닥 DNA는 두가닥 DNA를 끓임(denature, 변성)으로써 간단하게 얻을 수 있다. DNA polymerase가 DNA합성을 시작하게 위해서는 시작부위가 두가닥 DNA로 되어 있어야한다. 따라서, 증폭시킬 DNA sequence의 양 끝에 상보적으로 결합할 수 있는 작은 DNA조각(oligonucleotide primer)을 함께 넣어주면 이 primer가 특정 DNA sequence의 양 끝에 가서 결합(anneal)해 DNA polymerase가 DNA 합성을 시작할 수 있도록 해준다. 일단 primer가 결합한후에는 DNA polymerase의 작용으로 DNA 합성이 반대편 끝까지 진행(extend)된다. 이렇게 1)denatu…(생략)

1.얼음을 준비해서 미리 10Xbuffer 와 dNTP, primer, template(RTBP/pBlue스크립트)를 녹인다.(RTBP는 pblue스크립트 에 들어가 있으며 Top3의 크기는 2kb)

2. PCR tube 하나당 10Xbuffer를 1X가 되게, template(20ng/㎕)를 20ng되게, dNTP(2.5mM/㎕)를 10mM이 되게 Taq polymerase(5unit/㎕)를 1unit 이 되게 primer를 2pmole 이 되게 넣고 나머지를 물로 채워 50㎕을 맞춘다.(Taq polymerase는 마지막에 냉장고에서 꺼내 넣는다.)

3.tube 마다 mineral oil 2 방울 정도씩 떨어뜨린후 thermal cycler에서 PCR 시작.

1)predenature : 94℃ - 10분

2)denature : 94℃ - 1분

3)post elonga