½ÇÇè¹æ¹ý
1. Agar plate(LB ¶Ç´Â SOB)¿¡ ÀÚ¶õ E.coli DH5a colony¸¦ SOB medium 3 ml(20 mMÀÌ µÇµµ·Ï 2 M MgCl2¸¦ 30 ml ÷°¡)¿¡ Á¢Á¾ÇÑ ÈÄ ¹ã»õ Å°¿î´Ù. È¿À²À» Áõ°¡½ÃÅ°±â À§Çؼ´Â -70¡ÆC deep freezer¿¡ º¸°üÇÑ frozen bacterial stock¿¡¼ »õ·Î streakÇÑ plate¸¦ »ç¿ëÇÏ´Â °ÍÀÌ ÁÁ´Ù.
2. À§¿¡¼ ÀÚ¶õ ±Õ 2 ml¸¦ 200 mlÀÇ SOB medium(20 mMÀÌ µÇµµ·Ï 2 M MgCl2 ¸¦ 2 ml ÷°¡)¿¡ ´Ù½Ã Á¢Á¾ÇÑ ÈÄ O.D.600ÀÌ 0.4°¡ µÉ ¶§±îÁö shaking incubator¿¡¼ Å°¿î´Ù. º¸Åë ¾à 3¢¦4½Ã°£ÀÌ ¼Ò¿äµÇ¸ç, ¾à 2½Ã°£ ÀÌÈĺÎÅÍ 30ºÐ¸¶´Ù O.D.¸¦ °è¼Ó ÃøÁ¤Çغ¸´Â °ÍÀÌ ÁÁ´Ù(È¿À²À» Áõ°¡½ÃÅ°±â À§Çؼ ¹è¾çµÈ ¼¼±Õ ¼ö°¡ 108 cells/ml¸¦ ³ÑÁö ¾Ê´Â °ÍÀÌ ÁÁ´Ù). À̷лó E.coli´Â ÃÖÀû Á¶°Ç¿¡¼ doubling timeÀÌ 20ºÐÀ̹ǷΠÀÌ¿¡ ¸ÂÃß¾î ½Ã°£À» ÃßÁ¤ÇØ º¼ ¼ö ÀÖÀ¸³ª ¹è¾çÁ¶°ÇÀ» °í·ÁÇØ¾ß ÇÑ´Ù.
3. ¹è¾ç¾×À» ¸ê±ÕµÈ 50 ml conical tube 4°³¿¡ ³ª´©¾î ³Ö°í ¾óÀ½¿¡ 10ºÐ ¹æÄ¡ÇÑ´Ù.
4. 4,500 rpm, 4¡ÆC¿¡¼ 5ºÐ°£ ¿ø½ÉºÐ¸®ÇÑ ÈÄ »óÃþ¾×À» Á¦°ÅÇÏ°í tube¸¦ µÚÁýÀº »óÅ·Π¾à 1ºÐ°£ ³õ¾ÆµÐ´Ù.
5. ¹è¾ç ºÎÇÇÀÇ 1/3(tube´ç 15 ml) µÇ´Â frozen storage buffer(FSB)¿¡ ¼¼Æ÷ħÀü¹°À» ºÎÀ¯ ½ÃŲ ´ÙÀ½, µÎ tube¾¿ ÇÕÃļ 30 ml ¾¿À¸·Î ¸¸µç ÈÄ ¾óÀ½¿¡ 10ºÐ ³õ¾ÆµÐ´Ù. FSBÀÇ ¼ººÐÀº Ç¥ 1°ú °°´Ù.
u¡¦(»ý·«)
6. À§¿Í °°ÀÌ ´Ù½Ã ¿ø½ÉºÐ¸®ÇÑ ÈÄ Ã³À½ ¹è¾ç ºÎÇÇÀÇ 1/12.5(tube ´ç 8 ml)µÇ´Â FSB¿¡ ºÎÀ¯½ÃÅ°°í, µÎ tube¸¦ ÇÕÃļ 16 ml·Î ¸¸µç´Ù.
7. DMSO¸¦ 3.5%(V/V)¸¸Å °¡ÇÑ´Ù(560 ml). À̶§ DMSO´Â ¼¼Æ÷ ºÎÀ¯¾×ÀÇ Áß¾Ó¿¡ ¶³¾î¶ß¸®°í °ð¹Ù·Î tube¸¦ ±â¿ïÀÌ¸é¼ 5¢¦10ÃÊ°£ ºÎµå·´°Ô ¼¯µµ·Ï ÇÑ´Ù.
8. ¾óÀ½¿¡ 5¢¦15ºÐ ³õ¾ÆµÐ´Ù.
9. ´Ù½Ã °°Àº ¾çÀÇ DMSO¸¦ °¡ÇÏ¿© ÃÖÁ¾ ³óµµ°¡ 7%(V/V)ÀÌ µÇµµ·Ï ÇÏ°í, ¾óÀ½¿¡ 10~15ºÐ µÐ´Ù.
10. ¹Ì¸® Â÷°Ô ÇØ µÐ microfuge tube¿¡ 200 ml ¾¿ ºÐÁÖÇÑ´Ù.
11. »ç¿ëÇÒ ¶§±îÁö -70¡ÆC deep freezer¿¡ º¸°üÇÑ´Ù. »ó¿Â¿¡ ³ª¿Í Çѹø ³ì¾Ò´ø competent cellÀº ´Ù½Ã º¸°üÇÒ °æ¿ì È¿À²ÀÌ ´ë´ÜÈ÷ °¨¼ÒÇϹǷΠ¹ö·Á¾ß ÇÑ´Ù.
|